Меню Рубрики

Метод определение билирубина метод грофа

Лабораторная диагностика. Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Определение содержания билирубина и его фракций в сыворотке крови колориметрическим диазометодом (по Йендрашику-Клеггорну-Грофу)

Принцип метода. При взаимодействии сульфаниловой кислоты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфониевая кислота, которая реагирует со связанным билирубином и дает красное окрашивание. По интенсивности его судят о концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива свободный билирубин переходит в растворимое диссоциированное состояние, благодаря чему он также вызывает красное окрашиваниераствора. По интенсивности последнего определяют концентрацию общего билирубина. Свободный билирубин равен разнице между общим и связанным.

Ход определения. В три пробирки (для определения уровня общего билирубина, связанной фракции и постановки контрольной пробы на цвет сыворотки) вводят реактивы согласно схеме (табл.2.).

Данные для определения уровня билирубина в сыворотке крови

Реактив, мл Общий билирубин Конъюгированный билирубин Контрольная проба
Сыворотка 0,25 0,25 0,25
Кофеиновый реактив 1,75 1,75
Физиологический раствор 1,75 0,25
Диазосмесь 0,25 0,25

Колориметрируют пробы при зеленом светофильтре (500-560 нм); применяют кювету с шириной слоя 5 мм. Оценку результатов проводят по калибровочному графику, построенному в соответствии с инструкцией к наборам реагентов «Билирубин – эталон» фирмы «Лахема».

Находят содержание общего и связанного билирубина в мкмоль/л. Для определения уровня свободной фракции из цифр общего билирубина вычитают показатель конъюгированного.

В норме концентрация общего билирубина в плазме (сыворотке) крови составляет 8,55-20,52 мкмоль/л. 75% его количества приходится на долю свободной фракции.

Средние величины содержания в плазме общего, конъюгированного и свободного билирубина составляют соответственно 11,12; 2,57 и 8,56 мкмоль/л.

Клинико-диагностическое значение исследования

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Как то на паре, один преподаватель сказал, когда лекция заканчивалась — это был конец пары: «Что-то тут концом пахнет». 8702 — | 8256 — или читать все.

источник

Унифицированный метод определения билирубина по диазореакции (метод Ендрассика-Грофа)

Принцип метода: Под воздействием НСI разрывается связь билирубина и образуется два дипиррола, которые диазотируются диазобензо сульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 125 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до 50-60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доводят водой до 100 мл.

5. Натрия хлорид: 154 ммоль/л (изотонический раствор: 0,9 г хлорида натрия в 100 мл воды.

8. Диазосмесь. Диазореактив 1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300-400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСI, раствор доливают до 1 л. Диазореактив 2: натрия нитрит 5г/л: 0,5 г нитрита натрия в 100 мл воды. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива 1 и 0,3 мл диазореактива 2.

9. Билирубин для построения калибровочного графика 800 мг/л.

10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного Na2СО3 растворяют и доводят до 1 л водой.

11. Уксусная кислота, 4 моль/л; 25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл водой.

Ход определения: В три пробирки: две опытные и одну холостую вносят реактивы: по 0,5 мл сыворотки крови, кофеиновый реактив вносят в первую опытную пробирку для определения общего билирубина и в холостую пробу по 1,75 мл, во вторую опытную не вносят. Затем во вторую опытную (это определение связанного билирубина) прибавляют 1,75 мл и в холостую пробу 0,25 мл раствора хлорида натрия. Вносят диазосмесь в первую и во вторую опытные пробирки по 0,25 мл.

Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5-10 минут после добавления диазосмеси, при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 минут, после чего измеряют на ФЭК при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику.

Основной раствор билирубина: в колбе на 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30-35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2СО3 и несколько раз перемешивают, доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором карбоната натрия.

Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают. Этот раствор содержит на 100 мг/л билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.

Читайте также:  Что показывает билирубин в крови у новорожденного

Для ее приготовления смешивают 13,9 мл той же сыворотки, 2мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.

К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 минут.

Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным: в 5 пробирок прибавляют 0,05 мл; 0,1 мл; 0,15 мл; 0,2 мл; 0,25 мл рабочего раствора билирубина, добавляют с первой по пятую: 0,45 мл; 0,4 мл; 0,35 мл; 0,3 мл; 0,25 мл изотонического раствора хлорида натрия. В пробах количество билирубина соответствует с первой по пятую пробирки: 0,005; 0,01; 0,015; 0,02; 0,025 мг. Концентрация билирубина в сыворотке крови: 17,1 мкмоль/л; 34,2 мкмоль/л; 51,3 мкмоль/л; 68,4 мкмоль/л; 85,5 мкмоль/л.

Нормальные величины. В сыворотке крови содержится 8,5-20,5 мкмоль/л общего билирубина, из которого 75% приходится на долю свободного билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: Сдача сессии и защита диплома — страшная бессонница, которая потом кажется страшным сном. 9100 — | 7340 — или читать все.

источник

ЕНДРАШИКА-КЛЕГХОРНА-ГРОФА МЕТОД

ЕНДРАШИКА-КЛЕГХОРНА-ГРОФА МЕТОД (L. Jendrassik, R.A. Cleghorn, P. Grof) — количественный фотометрический метод определения прямого и непрямого билирубина в сыворотке крови.

Принцип метода заключается в том, что при взаимодействии сульфаниловой к-ты с азотистокислым натрием образуется диазофенилсульфоновая к-та (см. Диазореакция), к-рая с билирубином-глюкуронидом (см. Глюкурониды), так наз. прямым билирубином, сыворотки крови дает розово-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окраски определяют количество прямого билирубина (см.).

При добавлении к сыворотке крови кофеинового реактива несвязанный (непрямой) билирубин превращается в растворимый (прямой) и определяется количественно с диазореактивом. По интенсивности окрашивания определяют концентрацию в сыворотке крови общего билирубина, а по разности между общим и связанным (прямым) билирубином определяют количество несвязанного билирубина.

Реактивы. 1. Кофеиновый реактив: 5 г чистого кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г уксуснокислого натрия (CH3COONa•ЗН2O) растворяют в 90 мл дист, воды, нагревают до 50—60°, перемешивают, охлаждают и доводят дист, водой до 100 мл. 2. Изотонический р-р хлорида натрия. 3. Диазосмесь, приготовленная непосредственно перед работой и состоящая из 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II. Диазореактив I: 1,5 г сульфаниловой к-ты растворяют при нагревании в 300—400 мл дист, воды, добавляют 15 мл конц. соляной к-ты с уд. весом 1,19; после полного растворения сульфаниловой к-ты и охлаждения р-ра его доливают дист, водой до 1 л. Хранят в темной склянке. Диазореактив II: 0,5% р-р азотистокислого натрия (NaNO2). Хранят в темной склянке не более 2—3 нед.

Ход определения: в 3 пробирки (общий и прямой билирубин — 1-я и 2-я пробирки и контроль — 3-я пробирка) наливают по 0,5 мл разведенной в 2 раза сыворотки крови; в 1-ю и 3-ю пробирки добавляют по 1,75 мл кофеинового реактива, во 2-ю и 3-ю пробирки добавляют соответственно 1,75 и 0,25 мл изотонического р-ра хлорида натрия и затем в 1-ю и 2-ю пробирки добавляют диазосмесь по 0,25 мл.

Для определения прямого билирубина колориметрирование проводят при 536 нм через 5—10 мин. после добавления диазосмеси; для определения общего билирубина пробы колориметрируют через 20 мин. против воды. Используют кюветы 0,5 см шириной. Расчет производят по калибровочной кривой.

В норме в сыворотке крови человека содержится 0,5—1,2 мг% общего билирубина, 75% его приходится на долю непрямого билирубина.

Е.— К.— Г. м. принят в качестве унифицированного клин, лабораторного метода.

Библиография: Биохимические методы исследования в клинике, под ред. А. А. Покровского, с. 383, М., 1969; Джорджеску П. и Пэунеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования, пер. с румын., с. 163, Бухарест, 1963; Jendrassik L. u. С leghorn R. A. Photometrische Bilirubinbestim-mung, Biochem. Z., Bd 289, S. 1, 1936, Bibliogr.; Jendrassik L. u. Crof P. Vereinfachte photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins, ibid., Bd 297, S. 81, 1938.

источник

Билирубин и его фракции

Для исследования общего билирубина и его фракций применяются:

1. Прямые спектрофотометрические методы, основаны на измерении абсорбции билирубина при 440‑460 нм, источником ошибок здесь является интерференция желтых небилирубиновых пигментов;

2. Ферментативные методы, основаны на окислении пигмента медьсодержащим ферментом билирубиноксидазой (КФ 1.3.3.5.), с образованием биливердина и исчезновением абсорбции при 460 нм. Методы этой группы точны и отличаются высокой специфичностью и чувствительностью;

Читайте также:  Синдром жильбера повышается прямой билирубин

3. Колориметрические диазометоды , базируются на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. Под воздействием кислоты разрывается тетрапирроловая структура билирубина с образованием двух дипирролов, углеродные атомы метиленовых групп вступают в прямую реакцию с диазотированной сульфоновой кислотой (диазосмесь) с образованием розово-фиолетовых изомеров азодипиррола с максимумом поглощения при 530 нм. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный –– только после добавления акселератора (кофеин, метанол, мочевина, бензоат или гидроокись натрия, уксусная кислота и другие). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания. Образовавшийся азокраситель ведет себя как кислотно-основной индикатор с несколькими цветными переходами: в сильнокислой среде он окрашен в фиолетовый цвет, в слабощелочной и слабокислой — в розовый, в сильнощелочной среде — в синий или зеленый цвета.

4. Электрохимические методы с использованием платинового и ртутного электродов;

5. Хроматографическое разделение отдельных фракций билирубина;

6. Флюорометрические методы, используется свойство свободного билирубина после поглощения при 430 нм испускать свет длиной 520 нм. Позволяют определить концентрацию неконъюгированного билирубина и, после обработки детергентом, общего билирубина главным преимуществом метода является возможность использовать микроколичества сыворотки.

Унифицированным методом определения количества билирубина в сыворотке является метод Йендрашика‑Клеггорна‑Грофа по диазореакции в щелочной или слабокислой среде в присутствии акселератора.

Определение концентрации билирубина и его фракций
в сыворотке крови по диазореакции

Принцип

Билирубин взаимодействует с диазотированной сульфоновой кислотой в присутствии кофеина с образованием окрашенных азопигментов.

Нормальные величины

Сыворотка (диазореакция) Прямой билирубин
Взрослые 2,2‑5,1 мкмоль/л
Общий билирубин
Дети Доношенные Недоношенные
кровь из пуповины Завышенные результаты вызывает гемолиз, прием стероидных препаратов, эритромицина, фенобарбитала, употребление пищи, содержащей каротиноиды (морковь, абрикосы). Длительное стояние сыворотки на свету вызывает окисление билирубина и занижает значения.

Клинико‑диагностическое значение

Сыворотка

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая или надпеченочная желтуха — ускоренное образование билирубина в результате внутрисосудистого гемолиза. Это гемолитические анемии различного происхождения: отравление сульфаниламидами,талассемии, сепсис, лучевая болезнь, несовместимость крови, врожденный сфероцитоз, серповидно-клеточная анемия, дефицит глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

В данном случае гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. Гепатоциты усиленно переводят непрямой билирубин в связанную форму, секретируют его в желчь, в результате в кале увеличивается содержание стеркобилина, интенсивно его окрашивая. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует.

У новорожденных гемолитическая желтуха может развиться как симптом гемолитической болезни новорожденного.

2. Паренхиматозная (печеночно-клеточная) желтуха – причиной может быть нарушение на всех стадиях превращения билирубина в печени: извлечение билирубина из крови печеночными клетками, его конъюгирование и секреция в желчь. Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при отравлении токсическими гепатотропными веществами, при врожденных патологиях.

Так как в печени недостаточно проходят все реакции превращения билирубина, гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций, преимущественно фракции прямого билирубина. Количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов и/или снижения их количества, а прямого — за счет увеличения проницаемости мембран клеток печени, также из-за нарушения секреции в желчь.

В моче определяется билирубин (цвет крепкого черного чая), умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

3. Механическая или подпеченочная желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока – желчные камни, новообразования поджелудочной железы, гельминтозы. Также подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается проницаемость их стенок. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и развивается гипербилирубинемия за счет увеличения концентрации прямого билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина (цвет темного пива) и снижено количество уробилина, в кале практически отсутствует стеркобилин (серовато-белое окрашивание).

В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация его с глюкуроновой кислотой может нарушаться и в крови будет увеличиваться количество несвязанного билирубина, т.е. присоединяется печеночно-клеточная желтуха.

Закупорка внепеченочных желчных путей является классической причиной билирубинурии. Показатель полезен в дифференциальной диагностике желтух, поскольку билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух (повышение уровня связанного билирубина в сыворотке), но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Амниотическая жидкость

Билирубин содержится почти исключительно в неэтерифицированном виде в комплексе с альбумином и накапливается при эритробластозе, инфекционном гепатите и серповидноклеточном кризе у матери.

источник

Методы определения билирубина и его метаболитов

Определение билирубина в сыворотке крови

В клинической практике используются различные методы определения билирубина и его фракций в сыворотке крови.

Наиболее распространенным из них является биохимический метод Ендрассика-Грофа. Он основан на взаимодействии билирубина с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием азопигментов. При этом связанный конъюгированный билирубин (билирубин-глюкуронид) дает быструю («прямую») реакцию с диазореактивом,тогда как реакция непрямого свободного (не связанного с глюкуронидом) билирубина протекает значтельно медленнее. Для ее ускорения применяют различные вещества–акселераторы, например кофеин (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа), которые освобождают билирубин из белковых комплексов («непрямая» реакция). В результате взаимодействия с диазотированной сульфаниловой кислотой билирубин образует окрашенные соединения. Измерения проводят на фотометре.

Нормальная концентрация в крови:

общий билирубин — 8,5-20,5 мкМ/л,
связанный (прямой) билирубин — 0,9-4,3 мкМ/л,
свободный (непрямой) билирубин — 6,4-17,1 мкМ/л,
в моче у здоровых людей не определяется,

Уробилиноген в моче — 0,08-4,23 мкМ/сутки,
Стеркобилиноген в кале — 50-300 мл/сутки.

Рефферентные значения нормальных показателей общего, непрямого и прямого билирубина для взрослых, и детей приведены в таблице:

У взрослых и детей старше 1 месяца У детей до 1 месяца
Общий 8,5 — 20,5 мкмоль/л При рождении 51-60 мкмоль/л, со 2 дня и до конца первой недели может нарастать до 256 мкмоль/л за счёт непрямого (у недоношенных до 170 мкмоль/л). К концу 3 недели приближается к показателю для взрослых
Непрямой До 15,4 мкмоль/л (75% от общего) В пиковый период Не менее 90 % от общего
Прямой До 5,1 мкмоль/л (25% от общего) В пиковый период Не более 10 % от обшего

Таблица 2. Дифференциально-диагностические критерии желтух

Показатели Тип желтухи
Механическая Паренхиматозная Гемолитическая
Анамнез ЖКБ в анамнезе, операции на жёлчных путях, снижение массы тела Контакт с больными желтухой, инфекционные забол,токсические воздействия Появление желтухи в детском возрасте, подобные заболевания у родственников
Окраска Жёлтая с зеленоватым оттенком (verdinicterus) Жёлтая с оранжево- красным оттенком (rubinicterus) Лимонно-жёлтая (flavinicterus)
Интенсивность желтухи От умеренной до резко выраженной, интермитти- рующий характер Умеренно выражена Умеренно выражена
Кожный зуд Выражен Отсутствует Отсутствует
Боли в правом подреберье Частые, носят интенсивный характер Редкие, выражены слабо Отсутствуют
Тяжесть в области печени Не характерна Часто в начальный период болезни Отсутствует
Размеры печени Не изменены Увеличены Не изменены
Размеры селезёнки Не изменены Увеличены Не изменены
Цвет мочи Тёмный Тёмный Не изменён
Цвет кала Обесцвечен Обесцвечен Не изменён или тёмный
Уробилин в моче Отсутствует (при полной обтурации) Отсутствует в начальный период болезни, затем может быть повышен Резко повышен
Билирубин сыворотки крови Повышен за счёт прямой фракции Повышен за счёт обеих фракций Повышен за счёт непрямой фракции
Щелочная фосфатаза сыворотки крови Повышенный уровень Уровень не изменён Уровень не изменён
АЛТ, ACT сыворотки крови Незначительно повышены при длительных сроках желтухи Повышенный уровень Уровень не изменён

Минеральный обмен

Общие понятия. Функции минеральных веществ

Промежуточный и конечный обмен минеральных веществ

Характеристика отдельных элементов

Обмен воды и электролитов

Минеральный обмен – совокупность процессов всасывания, распределения, усвоения и выделения минеральных веществ, находящихся в организме преимущественно в виде неорганических соединений.

Всего в организме обнаруживается свыше 70 элементов таблицы Д.И. Менделеева, 47 из них присутствуют постоянно и называются биогенными. Минеральные вещества играют важную роль в поддержании кислотно-основного равновесия, осмотического давления, системе свертывания крови, регуляции многочисленных ферментных систем и пр., т.е. имеют решающее значение в создании и поддержании гомеостаза.

По количественному содержанию в организме они делятся на макроэлементы, если их больше чем 0,01 % от массы тела (К, Са, Мg, Na, P, Cl) и микроэлементы (Mn, Zn, Cr, Cu, Fe, Co, Al, Se). Основную часть минеральных веществ организма составляют хлористые, фосфорнокислые и углекислые соли натрия, кальция, калия, магния. Соли в жидкостях организма находятся в частично или полностью диссоциированном виде, поэтому минеральные вещества присутствуют в виде ионов – катионов и анионов.

В результате биохимического исследования крови можно установить содержание магния (0,8-1,2ммоль/л), железа (9,0-31,3 мкмоль/л), натрия (135-145 ммоль/л), калия (3,5-5,0 ммоль/л), кальция (2,23-2,57 ммоль/л), фосфора (0,8-1,45 ммоль/л), хлора (95-105 ммоль/л).

Функции минеральных веществ:

1) пластическая (кальций, фосфор, магний);

2) поддержание осмотического давления (калий, натрий, хлор);

3) поддержание буферности биологических жидкостей (фосфор, калий, натрий);

4) поддержание коллоидных свойств тканей (все элементы);

5) детоксикационная (железо в составе цитохрома Р-450, сера в составе глутатиона);

6) проведение нервного импульса (натрий, калий);

7) участие в ферментативном катализе в качестве кофактора или ингибитора;

8) участие в гормональной регуляции (йод, цинк и кобальт входят в состав гормонов).

источник

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

Adblock
detector