Меню Рубрики

Реактив эрлиха для билирубина

Эрлиха диазореакция

Эрлиха диазореакция — это качественная проба обнаружения биологически важных веществ в крови и моче. Основана на неспецифической цветной реакции между диазореактивом Эрлиха и некоторыми органическими веществами (пиррол, крезол, индикан, белки, содержащие аминокислоты тирозин, триптофан, гистидин и др.).

Диазореакция в моче. Реактивы: 1) диазореактив (0,5 г сульфаниловой кислоты и 5 мл 25% раствора соляной кислоты в 100 мл воды); 2) 0,5% раствор азотистокислого натрия.

Методика выполнения этой реакции: к 4 мл I реактива прибавляют 1—2 капли II реактива, приливают 4 мл мочи, потом 1 мл 10% раствора аммиака; пробирку закрывают пробкой и взбалтывают жидкость до появления пены. Проба считается положительной при розовой или красной окраске и отрицательной — при желтой или оранжевой. Положительная реакция наблюдается при многих лихорадочных заболеваниях: брюшном и сыпном тифе, милиарном туберкулезе, лимфогранулематозе, кори, трихинеллезе и др. При наличии билирубина в моче появляется с диазореактивом красное окрашивание мочи еще до прибавления аммиака.

Диазореакция в крови. Применяется при определении билирубина, с которым смесь диазореактивов в определенных соотношениях дает красное окрашивание. Диазореакция Эрлиха лежит в основе большинства методов количественного и качественного определения билирубина (см.).

Эрлиха диазореакция (P. Ehrlich) — это цветная реакция между диазореактивом Эрлиха и рядом органических веществ (пиррол, крезол, индикан и др.), вступающих в соединение с азогруппой (—N=N—), используемая для количественного определения биологически важных веществ в крови и моче.

Приготовление диазореактива: в раствор 5 г сульфаниловой кислоты в 50 мл крепкой соляной кислоты (d=1,12) добавляют воду до объема 1 л; к полученному раствору добавляют 0,5% раствор азотистокислого натрия. При этом образуется диазофенилсульфоновая кислота (реактив Эрлиха), которая образует окрашенные азосоединения с некоторыми биологически важными веществами, находящимися в крови и моче.

Широкое применение диазореакция Эрлиха получила в клинике при качественном и количественном определении билирубина в крови (см. ниже). Диазореактив используют также для определения тирозина, гистидина и гистамина. Белки, в молекулу которых входят аминокислоты — тирозин, триптофан и гистидин, дают с диазореактивом оранжево-красное окрашивание. При определении некоторых веществ в качестве компонента для получения окрашенного азосоединения употребляется не сульфаниловая кислота, а другие циклические соединения, например при определении фенолов в крови и в моче — паранитроанилин, при определении сульфаниламидов — 2R-кислота и т. д.

Диазореакция в крови. Билирубин при диазореакции дает характерное красно-фиолетовое окрашивание. Это явление было использовано для большинства методов качественного и количественного определения билирубина крови. В настоящее время чаще всего применяют метод Ендрашика, позволяющий определять раздельно фракции билирубина.

Реактивы: а) кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензойнокислого натрия и 12,5 г уксуснокислого натрия растворяют при небольшом подогревании в дистиллированной воде и доливают водой до 0,1 л; б)диазореактив: первый реактив — 1 г сульфаниловой кислоты растворяют в небольшом количестве воды и, прибавив 15 мл концентрированной HCl, доливают водой до 1 л; второй реактив — 0,5% раствор азотистокислого натрия.

Перед употреблением смешивают 10 мл первого реактива и 0,25 мл второго. Для определения общего билирубина к 1 мл сыворотки приливают 3,5 мл кофеинового реактива и 0,5 мл диазореактива, а при определении прямого билирубина к 1 мл сыворотки прибавляют 3,5 мл физиологического раствора и 0,5 мл диазореактива. Хорошо перемешав, обе пробы через 5 мин. колориметрируют против компенсационного раствора, состоящего из 1 мл сыворотки, 3,5 мл кофеинового реактива и 0,5 мл физиологического раствора при зеленом светофильтре. Непрямой билирубин определяется вычитанием из общего прямого.

Диазореакция в моче состоит в прибавлении к 10 мл свежей мочи 10 мл диазореактива и 2 мл 10% раствора аммиака. При этом после энергичного взбалтывания появляется розовое или карминово-красное окрашивание. Реакция считается положительной, если окрашены не только жидкость, но и образовавшаяся пена. Желтый или оранжевый цвет свидетельствует об отрицательном результате. В сомнительных случаях образование на следующий день осадка сине-зеленого или черного цвета позволяет считать реакцию положительной. В настоящее время эта реакция не имеет практического значения, так как она неспецифична и характерна для многих лихорадочных заболеваний: брюшного и сыпного тифов, милиарного туберкулеза, полисерозита, кори, лимфогранулематоза, пневмонии, дифтерии, рожистого воспаления, трихинеллеза. Кроме того, лекарственные препараты: опий, морфин, дионин, атофан, гексаметилентетрамин, ревень, героин, хризаробин, сальварсан — дают похожее окрашивание, а препараты танина, фенол и его производные, крезол, гваякол и салол мешают реакции.

Читайте также:  Хронический вирусный гепатит в билирубин

источник

Применение реактива Эрлиха для скрининга заболеваний, связанных с нарушением порфиринового обмена

Гематологический Научный Цент РАМН, Москва, ИЧП «Агат», Москва.
(Проблемы гематологии и переливания крови, 1/98, стр.49—50.)

Увеличение выделения порфобилиногена (ПБГ) с мочой наблюдается при анемиях, связанных с нарушением порфиринового обмена. ПБГ является одним из главных маркеров острого состояния (атаки) при порфириях (острой перемежающей порфирии и порфирии Veriegata), в основе патогенеза которых лежат нарушения в синтезе гема, вызываемые дефицитом одного из ферментов его синтеза и экскрекцией с мочой предшественников — протопорфиринов.

Ввиду того, что клинически острые состояния при порфириях характеризуются комплексом терапевтических, нейрологических и психиатрических симптомов, таких как абдоминальные боли, тахикардия, гипертензия, поведенческие изменения, конвульсии, кома, парез дыхательной мускулатуры и др., определение ПБГ в моче наиболее целесообразно в нейрологических, психиатрических и хирургических стационарах.

В то же время при порфириях недопустимо применение целого ряда широко распространенных лекарств (барбитураты, этанол, хлорпропанид, сульфаниды и др.), поскольку они могут вызвать атаку порфирии. Поэтому определение ПБГ является основой для своевременной диагностики и адекватной терапии, поскольку в настоящее время существует препарат аргинат гематина (нормосанг), позволяющий купировать атаку при порфириях.

Обычно ПБГ, а также два других продукта порфиринового обмена — 5-d-аминолевулиновую кислоту (5-АЛК) и общие порфирины, количественно определяют методом колоночной хроматографии (например с применением наборов фирмы BioRad (США)). Определение этих показателей наиболее информативно для диагностики нарушений порфиринового обмена, однако реактивы эти чрезвычайно дороги, а методика сложна, что делает ее применение нецелесообразным в рамках рядового лечебного учреждения.

Определение ПБГ (а также 5-АЛК) можно проводить и по упрощенной схеме, применяя реактив Эрлиха, считая данный метод скринирующим, а при положительной реакции подтверждать указанными выше методами или обращаться в профильные лаборатории.

Реактив Эрлиха представляет собой раствор п-диметиламинобензальдегида 20 г/л в смеси ледяной уксусной и перхлорной кислот. При взаимодействии ПБГ с реактивом Эрлиха образуется порфобилиноген-альдегид, имеющий красную окраску. В качестве образца берется моча в первые 2—3 часа после мочеиспускания.

В ходе определения ПБГ к 0,5 мл мочи приливают 0,5 мл реактива Эрлиха. Реакцию следует считать положительной, если в первые 5 минут после добавления реактива Эрлиха произошло резкое изменение окраски (покраснение). При инкубации реакционной смеси более 5 мин возможно развитие окраски, не связанное с увеличением уровня ПБГ.

Используя хроматографические методы анализа, мы провели дифференциальную диагностику 65 больных, у которых наблюдались некоторые симптомы ОПП. У 25 больных диагноз ОПП был подтвержден. Применяя реактив Эрлиха по указанной методике, мы не обнаружили расхождения этого метода с данными колоночной хроматографии. Во всех положительных случаях наблюдалось резкое покраснение не позднее, чем через 1 мин, а в отрицательных — изменение окраски ранее, чем через 5 мин, не выявлено.

Учитывая тот факт, что в некоторых случаях при атаке при острой перемежающей порфирии вначале резко повышается содержание 5-d-аминолевулиновой кислоты (5-AЛК), которая также является предшественником порфиринов, рекомендуется, при наличии клинических симптомов и отрицательной пробы на ПБГ, провести определение 5-AЛК.

Для этого следует к 1 мл исследуемой мочи прибавить 0,5 мл ацетилацетона и пробу прогреть в водяной бане при 100.С в течение obr>10—15 мин. Затем прибавить 0,5 мл реактива Эрлиха и если в первые 5 минут произошло покраснение, то реакцию можно считать положительной.

Необходимо помнить, что в случае хранения мочи свыше 3 часов при комнатной температуре реакция может стать ложноотрицательной, что, по-видимому, связано с превращением ПБГ в порфирины и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2—3 часа, ее хранят в холодильнике при 4.С или в замороженном состоянии. При доведении рН мочи до 6,0—7,0 и хранении в холодильнике ПБГ стабилен длительное время.

Кроме того, посуда, используемая для проведения реакции должна быть свободна от следов моющих средств, которые могут вызвать ложноположительную реакцию.

При ярко выраженной положительной реакции на ПБГ или 5-АЛК и наличии клинических симптомов следует принять меры, необходимые для предупреждения атаки или ее купирования. Однако, данный метод является скрининговым, а его положительный результат лишь указывает на возможность наличия нарушений порфиринового обмена. Для установления диагноза, а также для определения динамики заболевания и его лечения требуется количественное определение ПБГ, АЛК, и общих порфиринов хромотографическим методом. Рекомендуется при обнаружении положительной реакции обращаться Гематологический Научный Цент РАМН (ГНЦ РАМН).

Читайте также:  Место образования билирубина непрямого

В настоящее время ООО «Агат-Мед» выпускает набор реактивов для качественного определения порфобилиногена в моче «ПБГ АГАТ».

Cайт Гематологического Научного Центра РАМН, посвященный порфирии

источник

Анализ печени

2.Определение билирубина в сыворотке крови.

Принцип метода. Связанный билирубин при взаимодействии с диазореактивом (диазофенилсульфоновая кислота) образует розовое окрашивание, интенсивность которого пропорциональна концентрации билирубина, вступающего в прямую реакцию. Кофеиновый реактив переводит несвязанный билирубин в растворимое состояние, благодаря чему он также реагирует с диазореактивом, образуя розовое окрашивание. По интенсивности этого суммарного окрашивания определяют концентрацию общего билирубина. А концентрацию не связанного билирубина определяют как разность между общим и связанным билирубином.

Ход работы. В 3 пробирки приливают реактивы по схеме:

Через 5-10 мин после прибавления диазореактива колориметрируют пробу на связанный билирубин (при более длительном стоянии пробы в реакцию вступает несвязанный билирубин, что искажает результат). Пробу на общий билирубин колориметрируют через 20 мин после добавления диазореактива. Колориметрирование проводят при зеленом светофильтре в кювете толщиной 0,5 см против контроля. Концентрацию общего и связанного билирубина определяют по калибровочному графику.

Нормальное содержание билирубина в сыворотке: общий – 1,7-20,5 ммоль/л, связанный – 0,86-4,3 мкмоль/л, свободный – 1,7-17,1 мкмоль/л.

Диагностическое значение определения билирубина в сыворотке крови.

Причины, вызывающие гипербилирубинемию, различны. Желтуха появляется, когда уровень билирубина в крови превышает 43 мкмоль/л. Заболевания, вызывающие повышение связанного билирубина: вирусный гепатит, цирроз печени, опухоль печени и метастазы, жировая дистрофия.

Заболевания, вызывающие повышение несвязанного билирубина: гемолитическая анемия, пернециозная анемия, желтуха новорожденных.

Вопросы к защите лабораторной работы:

Объясните термины: общий билирубин, свободный билирубин, связанный билирубин, прямой билирубин, непрямой билирубин, конъюгированный билирубин, некоъюгированный билирубин.

Как образуется свободный билирубин?

Зачем в данном методе используется кофеиновый реактив?

Почему пробу на связанный билирубин колориметрируют точно через 5-10 минут?

Каков принцип метода определения билирубина в сыворотке крови?

Как определяют концентрацию общего и связанного билирубина?

Назовите причины гипербилирубинемии.

Какова норма свободного, связанного и общего билирубина?

3. Исследование порфиринового (пигментного) обмена

Для оценки состояния порфиринового обмена используют определение пигмента билирубина, являющегося продуктом распада гемпротеидов. Существуют два типа билирубина: неконъюгированный (свободный, который с диазореактивом дает непрямую реакцию, т.е. после растворения в этаноле) и конъюгированный (связанный с глюкуроновой кислотой, который сразу реагирует с диазореактивом). По соотношению фракций билирубина судят об изменении пигментного обмена.

Работа 65. Определение билирубина и его фракций в сыворотке крови по Йендрашику, Клеггорну и Грофу

Реактивы. Кофеиновый реактив*; хлорид натрия, 9 г/л раствор; диазореактив*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 2 мл; ФЭК.

Метод основан на способности связанной и диссоциированной формы свободного билирубина давать при взаимодействии с диазофенилсульфоновой кислотой азобилирубин розовато-фиолетового цвета. Свободный билирубин переводится в растворимое диссоциированное состояние кофеиновым реактивом, благодаря чему в этой пробе определяется общий билирубин. По разнице между общим и связанным билирубином находят концентрацию свободного билирубина.

Ход определения. В три пробирки вносят согласно таблице необходимые ингредиенты и тщательно перемешивают.

При определении общего билирубина пробы оставляют стоять на 20 мин для развития окраски, а связанного – на 5-10 мин (при длительном стоянии в реакцию вступает свободный билирубин).

По истечении указанного времени фотометрируют каждую пробу против воды на ФЭКе при 520-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см.

Расчет. Из полученных экстинкций общего и связанного билирубина вычитают экстинкцию контрольной пробы (контроль на мутность сыворотки) и находят по ним содержание общего и связанного билирубина (в мкмоль/л) по калибровочному графику (рис. 11). Свободный (неконъюгированный) билирубин рассчитывают по разнице между величинами общего и связанного билирубина.

Читайте также:  Как повысить билирубин в организме

Оформление работы. Рассчитать содержание общего билирубина и его фракций в сыворотке крови и сделать вывод о причине возможных отклонений этих показателей в исследуемом материале.

Практическое значение работы. В норме концентрация общего билирубина в сыворотке крови составляет 8,0-20,0 мкмоль/л; из этого количества 75% приходится на долю неконъюгированного (свободного) билирубина (6,0-15,0 мкмоль/л) и 25% – на долю конъюгированного (связанного) билирубина (2,0-5,0 мкмоль/л). Исследование содержания билирубина проводится в клинике для дифференциальной диагностики желтух. Желтушная окраска кожных покровов проявляется при уровне билирубина в крови выше 27 мкмоль/л. При надпеченочных желтухах (гемолитические анемии, желтуха новорожденных и др.) увеличивается содержание свободного билирубина в крови, при печеночных желтухах, возникающих вследствие поражения собственно клеток печени, повышается концентрация связанного билирубина в крови, а при подпеченочных желтухах, к которым относится механическая, наблюдается возрастание уровня как свободного, так и, в большей степени, связанного билирубина.

Определение прямого билирубина сыворотки крови

Ход работы. К 1 мл сыворотки крови прибавить 3,5 мл физраствора и 0,5 мл диазореактива. Через 5 минут полученную смесь помещают в кювету с толщиной 1 см и фотометрирует на ФЭКе при зеленом светофильтре против компенсационного раствора, содержащего 1 мл сыворотки, 3,5 мл физраствора и 0,5 мл воды. Норма: общий — 8,2-20,5 мкмоль/л или 0,5-0,9 мг% (75%-непрямой от общего билирубина);

Клинико-диагностическое значение. Повышение концентрации билирубина в крови до 20 мг/л приводит к развитию желтухи. Боле высокий уровень билирубина в крови вызывает явление тяжелого отравления. В крови количество и соотношение между прямым и непрямым билирубином резко меняются при поражениях печени, селезенки, костного мозга, болезнях крови и т.д., поэтому определение обеих форм билирубина в крови имеет существенное значение в клинике при дифференциальной диагностике желтух различной этиологии.

источник

Работа № 1. Количественное определение билирубина в сыворотке крови по методу Иендрашека

Принцип метода. В основе метода Иендрашека лежит реакция Ван ден Берга, описавшего способность билирубина давать розово-фиолетовое окрашивание с диазореактивом Эрлиха. Интенсивность образующейся окраски прямо пропорциональна концентрации билирубина в растворе. Разрушение билирубин-альбуминового комплекса (свободный, или непрямой билирубин) осуществляется кофеиновым реактивом, который одновременно переводит билирубин в растворимое диссоциированное состояние. Интенсивность образующейся окраски измеряется на ФЭКе при зеленом светофильтре (563 нм), а количество билирубина определяется по калибровочному графику.

Ход работы.В 3 пробирки отмерить указанные в таблице реактивы и колориметрировать через 5 — 10 мин. на ФЭКе в кювете 10 мм против контроля при зеленом светофильтре.

По калибровочному графику определить содержание общего и связанного билирубина. Вычитая из уровня общего билирубина количество прямого, рассчитать содержание непрямого (свободного) билирубина. Сопоставить с нормой содержания у здоровых людей и сделать вывод.

Реактивы Пробирки
1-я 2-я 3-я
Сыворотка крови 1 мл 1 мл 1 мл
Кофеиновый реактив 3,5 мл 3,5 мл
Диазореактив 0,5 мл 0,5 мл
Физиологический раствор 0,5 мл 3,5 мл
Типы билирубина общий контроль прямой (связанный)

Нормальное содержание билирубина в крови –8,5 – 20,5 мкмоль/л; 75% общего билирубина составляет непрямой (свободный), 25% — прямой (связанный) билирубин.

Клинико-диагностическое значение определения содержания билирубина в сыворотке крови:определение общего билирубина и его фракций используется для диагностики и дифференциальной диагностики желтух различной этиологии – гемолитической (надпеченочной), паренхиматозной (гепатоцеллюлярной, печеночной) и обтурационной (механической, подпеченочной). При гемолитической желтухе гипербилирубинемия развивается в основном за счет непрямого (свободного) билирубина. При паренхиматозной желтухе происходит деструкция гепатоцитов и нарушается экскреция прямого билирубина в желчные ходы, он попадает в кровь. Кроме того из-за функциональной несостоятельности гепатоциты не способны эффективно захватывать из крови непрямой билирубин и конъюгировать его. При паренхиматзной желтухе наблюдается гипербилирубинемия смешанного типа. При обтурационной желтухе нарушается эвакуация желчи в двенадцатиперстную кишку, что приводит к повышению в крови прямого, а в более поздние сроки болезни и непрямого билирубина.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Лучшие изречения: На стипендию можно купить что-нибудь, но не больше. 9350 — | 7414 — или читать все.

источник

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Adblock
detector